Caracterização genética, correlação antigênica e ecoepidemiológica dos vírus do grupo C (Bunyaviridae, orthobunyavirus) isolados nas américas

Até o presente momento, estudos moleculares para os vírus do grupo C (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) não foram publicados. O presente trabalho determinou as seqüências nucleotídicas completas para os segmento ARN pequenos (P-ARN) e a seqüencias parciais para os segmentos de ARN médio (M-ARN) dos vírus do grupo C. A seqüencia completa do segmento P-ARNvariou de 915 a 926 nucleotídeos, e revelou organização genômica semelhante em comparação aos demais ortobunyavírus. Baseado nos 705 nt do gene N, os membros do grupo C foram distribuídos em três grupos filogenéticos principais, com exceção do vírus Madrid que foi posicionado fora destes três grupos. A análise da cepa BeH 5546 do vírus Caraparu revelou que o mesmo apresenta seu segmento P-ARN semelhante ao do vírus Oriboca , sendo um vírus rearranjado em natureza. Em adição, a análise dos 345 nt do gene Gn para sete vírus do grupo C e para a cepa BeH 5546, revelou uma diferente topologia filogenética, sugerindo um padrão de rearranjo genético entre estes vírus. Estes achados representam as primeiras evidências de rearranjo genético em natureza entre os vírus do grupo C, dos quais vários são patógenos humanos. Finalmente, nossos dados genéticos corroboraram dados de relacionamento antigênico entre esses vírus determinados utilizando métodos sorológicos (testes de fixação de complemento, inibição da hemaglutinação e neutralização), sugerindo que a associação de dados informativos aos níveis molecular, sorológico e eco-epidemiológico podem contribuir para o melhor entendimento da epidemiologia molecular dos ortobunyavírus.

Caracterização molecular dos vírus do grupo Gamboa (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) isolados nas américas e infecção experimental em pintos (Gallus gallus domesticus) com o vírus Gamboa cepa Be AN 439546

Poucas informações estão disponíveis até o momento sobre os vírus do sorogrupo Gamboa (Bunyaviridae, Orthobunyavirus), desta forma, foi realizado, neste trabalho, estudo filogenético dos membros do sorogrupo Gamboa entre si e com outros orthobunyavírus ao nível gene Gn (M-RNA), além de infecção experimental em pintos recém nascidos da espécie Gallus gallus domesticus com a cepa Be AN 439546 do Vírus Gamboa (VGAM), e estudo sorológico em aves, outros animais silvestres e humanos de Tucuruí – Pará. A análise filogenética dos vírus do sorogrupo Gamboa demonstrou que esses vírus são geneticamente mais relacionados com membros do grupo Turlock e menos com os do grupo Simbu, e foram distribuídos em dois clados distintos (I e II), que estão de acordo com a atual classificação sorológica, de modo que o clado I inclui o complexo Gamboa e o clado II o complexo Alajuela. A cepa Be AN 439546 do VGAM apresentou tropismo pelo pulmão e fígado de pintos recém nascidos experimentalmente infectados, sendo a replicação viral nesses órgãos confirmada por imunohistoquímica, o que demonstra que o VGAM replica-se nessa ave. A detecção de anticorpos inibidores da hemaglutinação contra o VGAM e a confirmação por teste de neutralização em plasma de aves silvestres reforça a hipótese de que esses animais constituem o principal hospedeiro de amplificação no ciclo de manutenção do VGAM. Estudos moleculares do genoma completo dos vírus do sorogrupo Gamboa, assim como sobre a ecoepidemiologia do vetor e dos hospedeiros (principalmente aves), para o ciclo de replicação dos vírus, são importantes para confirmar as informações já existentes sobre esses vírus.

Caracterização molecular do vírus Melao cepas BE AR 633512 e BE AR 8033 (Bunyaviridae, Orthobunyavirus) e infecção experimental em hamsters dourados (Mesocricetus auratus)

As cepas do Virus Melao (VMEL), BE AR 8033 e BE AR 633512 foram isoladas de mosquitos Ochlerotatus (Ochlerotatus) scapularis, em Belém- PA (1955) e Alta Floresta do Oeste- RO (2000), respectivamente. Este trabalho teve como objetivo caracterizar molecularmente as cepas BE AR 633512 e BE AR 8033 e realizar estudos histopatológicos, bioquímicos e imunológicos comparativos em hamsters dourados (Mesocricetus auratus). Hamsters mostraram suscetibilidade às cepas do VMEL. A viremia em hamsters para BE AR 633512 ocorreu do 3º ao 6º dias pós-infecção (dpi.), e para a cepa BE AR 8033 ocorreu no 2º dpi. Anticorpos neutralizantes para ambas as cepas foram detectados a partir de 5 dpi., e se mantiveram até 30 dpi. As cepas testadas alteraram os marcadores bioquímicos AST, ALT e uréia, enquanto que a creatinina só apresentou alteração estatisticamente significante nos animais infectados com a cepa viral BE AR 633512, em comparação aos animais controles não infectados. Alterações histopatológicas foram observadas no SNC, fígado, rim e baço dos hamsters infectados pelas cepas do VMEL, sendo a infecção nesses órgãos confirmada por imunohistoquímica. A cepa BE AR 633512 foi mais virulenta e patogênica para hamsters que a cepa BE AR 8033. A análise genética dos genes N, Gn e Gc revelou que para os genes N e Gn, a cepa BE AR 8033 e do protótipo VMEL (TRVL 9375) são mais geneticamente relacionados. Para o gene Gc, a cepa BE AR 8033 é mais relacionada com a cepa BE AR 633512, sendo que esta última cepa apresentou maior variabilidade genética, principalmente no gene Gn com várias substituições de aminoácidos, mas as mutações no gene Gc provavelmente foram responsáveis pelo aumento da virulência e patogenicidade em hamsters.

Epidemiologia molecular do Vírus Oropouche (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) na Amazônia brasileira

O Virus Oropouche (VORO; Bunyaviridae, Orthobunyavirus) é um dos mais importantes arbovírus que infecta humanos na Amazônia brasileira, e é causador da febre do Oropouche. Entre 1961 e 2009, um grande número de epidemias foi registrado em diferentes centros urbanos dos Estados Brasileiros do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Pará, Rondônia e Tocantins, e também no Panamá, Peru e Trinidad & Tobago. Este trabalho teve por objetivo desenvolver um estudo retrospectivo dos aspectos epidemiológicos e moleculares do VORO enfatizando sua distribuição, a dinâmica das epidemias ocorridas no período, bem como a dispersão de diferentes genótipos na América Latina e no Brasil como contribuição à epidemiologia molecular do VORO. Para tanto 66 isolamentos do VORO pertencentes ao acervo do Instituto Evandro Chagas foram propagados em camundongos e em cultura de células VERO, seguida da extração do RNA viral e obtenção do cDNA por RTPCR; os amplicons foram purificados e submetidos ao sequenciamento nucleotídico para análises moleculares e evolução, incluindo o rearranjo genético, estudo de relógio molecular e análise de dispersão viral. Foi demonstrada a presença de quatro linhagens distintas do VORO na Amazônia brasileira (genótipos I, II, III e IV), sendo os genótipos I e II, respectivamente os mais frequentemente encontrados em áreas da Amazônia ocidental e oriental. Esses e o genótipo III estão constantemente evoluindo, mediante o mecanismo “boom and boost” que resulta na emergência seguida de substituição das sublinhagens (subgenótipos) circulantes por outras mais recentes. O genótipo III do VORO, previamente encontrado somente no Panamá, foi descrito na Amazônia e Sudeste do Brasil. Os dados obtidos pela análise filogenética comparativa das topologias para os segmentos PRNA e MRNA sugerem que o VORO utiliza o rearranjo genético como mecanismo de geração de biodiversidade viral, sendo o genótipo I o mais estável e o II o mais instável e, portanto, mais sensível às pressões evolutivas; foi reconhecido um novo genótipo do VORO neste estudo em amostras isoladas em Manaus no ano de 1980, que foi denominado de genótipo IV. O estudo do relógio molecular mostrou que a emergência do VORO se deu no Estado do Pará provavelmente há 223 anos e daí ao longo dos anos se dispersou pela PanAmazônia bem como para o Caribe, sendo que o genótipo I foi o que originou os demais genótipos do VORO.

Infecção experimental em hamster dourados (Mesocricetus auratus) e caracterização genética parcial de cinco Phlebovirus (Bunyaviridae) do Complexo Candiru isolados na Amazônia brasileira

Os flebovírus (família Bunyaviridae; gênero Phlebovirus), possuem importância considerável em saúde publica, pois podem causar uma variedade de síndromes clínicas. Na região amazônica brasileira até o momento já foram isolados 23 flebovírus sendo que quatro se destacam por terem sido isolados de humanos: Virus Alenquer, Virus Candiru, Virus Morumbi e Virus Serra Norte. Estes mais o Virus Itaituba, isolado de Didelphis marsupialis, fazem parte do Complexo Candiru (grupo Candiru) e foram utilizados para estudos de caracterização genética e de infecção experimental em hamsters dourados (Mesocricetus auratus). Os Hamsters mostraram-se suscetíveis a infecção por esses flebovírus, apesar de não terem apresentado sinais de doença. A análise histopatológica demonstrou aspectos lesionais no fígado, nos rins, no baço, nos pulmões e no sistema nervoso central, sendo as lesões mais intensas no fígado comprovadas pela presença dos antígenos virais empregando a técnica de imunohistoquímica. A análise das seqüências nucleotídicas parciais dos segmentos PRNA e MRNA obtidas para os cinco flebovírus estudados mostraram maior similaridade genética entre si do que com outros membros do gênero Phlebovirus. Sendo as mesmas geneticamente mais relacionadas ao Virus Punta Toro. Filogeneticamente, independentemente do segmento genômico analisado, os cinco flebovírus constituem um grupo monofilético, sendo que a análise pelo método de máxima verossimilhança demonstrou diferentes origens evolutivas para os segmentos de RNA o que sugere a ocorrência de rearranjo genético em natureza entre estes cinco flebovírus amazônicos.

Arbovírus Morumbi (Phlebovirus : Bunnyaviridae) - estudo histopatológico e imuno-histoquímico do fígado na infecção experimental em camundongos: comparação entre as vias cerebral, intraperitoneal e subcutânea

O vírus Morumbi é membro do sorogrupo Phlebotomus fever (família Bunyavírídae: gênero Phlebovírus) nativo da Região Amazônica. Seu vetor é desconhecido, mas supõem-se ser transmitido por flebotomíneos. Foi isolado em 1988 de ser humano apresentando quadro febril agudo. Este arbovírus, quando inoculado em camundongo por via cerebral, demonstrou viscerotropismo, induzindo inclusive lesões no fígado do animal inoculado. Com os objetivos de: i) estabelecer as características anátomo-patológicas e imuno-histoquímicas em fígado de camundongos albinos Swíss recém-nascidos experimentalmente infectados pelo vírus Morumbi; ii) verificar se o vírus apresenta hepatotropismo diferenciado na dependência de inoculação pelas vias cerebral, peritoneal ou subcutânea; iii) caracterizar detalhadamente os padrões anátomo-patológicos sequenciais no fígado; iv) demonstrar a localização do antígeno viral no tecido hepático ao longo da infecção experimental; v) estudar possíveis inter-relações entre os achados anátomo-patológicos e os imuno-histoquímicos. Foram estudados experimentalmente 71 camundongos Swíss recém-nascidos (dois e três dias), distribuídos ao final do experimento como segue: 21 animais inoculados por via intracerebral (IC), 21 por via intraperitoneal (IP) e 29 animais inoculados por via subcutânea (SC). Utilizou-se a dose infectante 5,0DL 50 /0,02ml de suspensão de vírus. Outros trinta, animais que não receberam inóculos, foram utilizados como grupo controle. Subgrupos de oito animais (seis inoculados e dois do grupo controle) foram sacrificados diariamente a intervalos de 24 em 24 horas, até 96 horas para os grupos IC e IP e até 120 horas para o grupo SC. Fragmentos de fígado de todos os animais foram fixados em solução de formalina neutra a 10%, incluídos em parafina, de onde foram obtidos cortes de 5 mm que foram corados pela técnica de hematoxilina-eosina para análise morfológica e, cortes adicionais, foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica (Sistema Envision, DAKO, USA), utilizando a fosfatase alcalina e soro hiperimune do vírus Morumbi preparado em camundongos jovens, para detecção de antígeno viral. Foram estudados seis parâmetros de lesão em áreas portais e nove outros nos lóbulos, que foram semiquantificados numa escala que variou de zero (0) a três cruzes (+++), onde zero significou ausência de lesão e três cruzes lesão intensa. À microscopia óptica, ficou evidente que o vírus Morumbi inoculado em camundongos por três diferentes vias induz lesões em áreas portais e lobulares, caracterizando uma hepatite aguda com presença de corpúsculos acidófilos, semelhantes aos corpúsculos de Councilman -Rocha Lima, de distribuição irregular nos lóbulos, cujo aparecimento foi observado 24 horas pós-inoculação (p.i.) e atingiu o máximo de intensidade às 72 horas p.i. em animais inoculados por via IP. O exame imuno-histoquímico mostrou presença leve de antígeno viral a partir de 24 horas p.i. no grupo IC e a partir de 48 horas p.i. nos grupos IP e SC, havendo certo paralelismo em relação a intensidade de lesão morfológica, tendo- se observado o máximo de detecção de antígeno viral em animais inoculados por via IP e sacrificados às 72 horas p.i. A distribuição geral de antígeno foi observada especificamente nos lóbulos hepáticos, no citoplasma de hepatócitos íntegros e necrosados e no interior de células de Kupffer, não havendo preferência por nenhuma das três zonas do lóbulo. Concluiu-se que: i) o modelo de infecção experimental em camundongos foi excelente para o estudo das lesões causadas pelo vírus Morumbi, podendo ser selecionada a via IP como referencial; ii) em todas as vias utilizadas (IP, IC e SC) se confirmou a infecção pelo vírus Morumbi com marcante detecção de seu antígeno, no tecido hepático de camundongos Swiss; iii) a presença de antígeno do vírus Morumbi no fígado desses camundongos associou-se ao aparecimento de hepatite aguda, com necrose focal; iv)hepatite intensa pôde ser observada em fígado de camundongos sacrificados 72 h p.i. com o vírus Morumbi por via IP, o que não foi verificado com as outras duas vias; v) a hepatite aguda mostrou-se limitada, neste experimento, tendendo a desaparecer na maioria dos camundongos inoculados, com avançar das horas; vi) colestase não alteração freqüente na hepatite experimental pelo vírus Morumbi, quando inoculada por via IC, IP e SC; vii) o antígeno do vírus Morumbi teve predominância pela localização intracitoplasmática, padrão granular, nos hepatócitos e células de Kupffer; viii) antígeno viral foi detectado em fragmento hepático de animais experimentalmente inoculados com o vírus Morumbi, a partir das 24 horas via IC e a partir de 48 horas nas vias IP e SC.

Soroprevalência de anticorpos e padronização do teste ELISA sanduíche indireto para 19 tipos de arbovírus em herbívoros domésticos

A região Amazônica brasileira mantém a maior variedade de arbovírus e o estado do Pará corresponde a 26% desse território, o presente trabalho teve como objetivo determinar a prevalência e a distribuição de anticorpos detectados por inibição de hemaglutinação (IH) para 19 arbovírus em herbívoros domésticos no estado do Pará e padronizar testes de ELISA sanduíche indireto em equinos, bovinos, bubalinos e ovinos. Em todas as espécies de animais estudadas e em todo estado do Pará ocorreu detecção de anticorpos para todos os arbovírus analisados dentre os quais os SLEV, ILHV, EEEV, MAGV e WEEV apresentaram maior prevalência de anticorpos IH, sendo o SLEV o mais prevalente. Na detecção de anticorpos para diferentes famílias de arbovírus o MAGV foi o mais prevalente da família Bunyaviridae em todas as espécies, o SLEV foi o mais prevalente da família Flaviviridae em todas as espécies, na família Togaviridae o EEEV foi mais prevalente em equinos. Ao analisar a prevalência de anticorpos IH por espécie animal foi observado que os equinos não apresentaram diferença significativa em relação aos bubalinos, porém, apresentaram diferença significativa maior em comparação aos bovinos e ovinos, não havendo diferença significativa entre as espécies de ruminantes. O uso de ELISA IgG sanduíche indireto apresentou grande frequência de reações sorológicas cruzadas entre as famílias de arbovírus estudadas.